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Biology/세포 생물학 Cell Biology

[1-1] Technology of cell biology (Ch8)

by ju_nope 2023. 2. 28.

사용 교재 : Molecular Biology of the Cell 5th (수업에선 6th인데 난 5th)

수업은 Chapter8 Manipulating Proteins, DNA, and RNA 부터 시작해서, Chapter 4, 7 10, 11,12 ... 23 까지 배우게 된다. 중간고사 범위는 Chapter 15 Cell Signaling part 2 까지이다. 

목차

    개요 

    21세기 들어 생명과학은 큰 발전을 이루었다. 다양한 분석기법들이 발명되며 DNA와 RNA, 단백질에 대한 폭발적인 정보를 얻게 되었다. 우리는 mRNA가 전사될 때 어떤 유전자가 발현되고, 어떤 단백질이 활성화 되는지, 그들이 단백질 또는 분자들과 상호작용할 때 어떤 pathway나 network를 거치는지 알고자 한다. 또한 세포들이 어떻게 그렇게 많은 다양한 변수들을 통제하며, Biological task를 수행할 때 어떻게 최적의 선택지를 골라내는지 또한 알고싶다. 

    그런 목적을 달성하기 위해서 다양한 분석기법들이 개발되었는데, 이번 장에서는 특히 몇몇 주요 방법들을 배우고자 한다. Cell 또는 protein, DNA, RNA의 molecular componets를 분석하는 기술들에 대해 먼저 배울 것이다. 

    기본 용어 

    • in vitro : in glass (시험관, 체외)
      • biochemistry에선 absence of living cell
      • cancer biology에선 absence of living organism
    • in vivo : in the living organism (생체내)
      • biochemistry에선 inside living cells
      • cancer biology에선inside living organism

    기술들 (Ch8)

    Isolating cells  

    • FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorter ) 

    Flow Cytometry 라고 불림. 여러 종류의 세포가 섞여 있을때 이를 같은 종류 세포끼리 분류할 수 있는 기술. 세포마다 다른 형광물질이 붙어있는 antibody를 붙인 뒤 용액의 속도가 점점 빨라지는 관을 지나게 하여 나란히 정렬하고 (Hydrodynamic Focusing) 이를 떨어트리며 세포마다 레이저를 조사. 형광물질이 있는 세포는 negative charge 되고, 그렇지 않은 세포는 positive charged 되어서 방울(droplet)단위로 나뉨. 여기에 전기장을 걸어주면 charge에 따라서 다른 방향으로 휘어짐. 이를 이용해 세포를 분류할 수 있음. 

    Culturing Cells

    • Cell line (세포주) : 세포를 in vitro 에서 배양. 세포가 기억을 잃은 상태(immortalized)
    • Organoid (장기유사체/미니장기) : 3D 구조를 가진 세포 배양체. 주로 단일 줄기세포로부터 배양되는데, 해당 조직의 histology를 유지하고 있음. 그래서 실제 장기와 비슷한 환경에서 테스트 가능. 
      • Personalized study가 가능하다. 예를 들면 개인별로 잘맞는 약과 잘맞지 않는 약을 미리 테스트해서 비용과 시간을 최소화할 수 있다. 
      • 한계점은 결국 In-vitro라는 점이다. (신체는 In-vivo 이므로) 

    위 표는 슬라이드에 포함되어있는 표인데, 아직 이해를 못했다.  모르는 부분은 교수님에 준하는 카이스트 석박과정 김동균 군에게 카톡으로 질문했다. 아래는 그 질문과 답변. 

    • 질문1. Clonality는 세포간의 동일성을 얘기하는 것 같은데, 저 네개 모두 같은 한 세포를 쭉 자기복제 시킨게 아닌가?  Clonality가 No인 경우는 무엇을 말하는 것인가? 
    동균이 답변 : Clonality는  Genetics Homogeneity라고 이해하면 된다. 유전적으로 동일한지 아닌지를 의미. 2D culture나 Spheroid의 경우 냅다 세포 여러개를 키우니까 그 하나하나는 전부  heterogenous하다. 이 경우엔 서로 다른 세포들이 clustering 된 것이기 때문에 genotype/phenotype 적으로 전혀 다르다. 그래서 clonality 가 없다. 하지만 물론 각각의 덩어리안에서는 유전적 정보가 모두 같다.  Organoid의 경우 한  Organoid  덩어리는 한 세포를 시작으로 분화유도인자를 넣어가며 만들어진 덩어리라 Spheroid와 다르게 Clonality가 Yes이다. 
    • 질문2. Self-renewal이 Organoid만 가능한 이유는 그것이 줄기세포이기 때문인가? 
    동균이 답변 : 정확하게 말하자면, 모든 올가노이드가 줄기세포인건 아니지만, 줄기세포"였지만" 분화가 완료된 것도 올가노이드에 '포함'되어있다. 줄기세포능이 있는 세포는 항상 올가노이드 내부에 포함되어있기 때문에 올가노이드의 일부가 제거된다해도 원래대로 renewal될 수있는 잠재력(potential)이 있다. 예를 들면 인간 장기 중에 간처럼. liver organoid는 self-renewal이 더 잘되기도 함. 
    • 질문3. No. of cell types와 long term culture에 대한 자세한 설명 (교수님이 제대로 안짚고 넘어갔으니 시험엔 안나올듯) 
    동균이 답변 : number of cell type을 의미, 앞의 3개( 2d, colony, spheroid)는 분화가 이미 다 되어있는 세포를 한 종류씩 키우는 것이라  cell type이 하나임. 근데 organoid는 선조세포에서 여러 물질들을 뿌려서 일부세포는  a세포로, 또 다른 일부세포는  b세포로 분화시켜서 한  organoid 내에 여러 cell type이 포함된 경우가 흔하다. 세포들이 전부 제멋대로 분화하기 때문에. 그래서 multiple인 것. 대표적인 예로 brain organoid가 있는데, 대부분의 경우 neuron이랑 glia cell이 같이 포함된 형태의, 조금더 우리 뇌에 가까운  organoid를 사용하는게 국룰이다. 
    Long term culture는  길게 키울수 있냐는 것인데, 나머지는 passage(계대, 쉽게말해 집이 꽉차지않게 불어날때마다 이사시켜주는거야)를통해 지속적으로 키울수잇는데, Spheroid는 (보통은) 오래 키우면서보기보단 짧은시간내에 뭔가를 treat해서 변화를 본다거나해서 no인 것. 물론 최근에는 spheroid도 organoid처럼 오래 maintain하면서 보기는 함. Organoid랑 spheroid 부분은 워낙 시대가 빨리변해서 애매한 부분도 워낙 많음.

    Purifying cells

    • Centrifuge : 원심 분리
      • FACS 이전의 Cell의 분리는 고전적인 원심분리로 이루어졌다. Cell의 밀도(혹은 크기)에 따라 핵->미토콘드리아->라이소좀->기타 등등 의 순서로 분류가 되었다. 
    • Chromatography : 크로마토그래피 (4종) 
      • Column Chromatography : 고전적인 크로마토 그래피. 중력에 대한 물질의 크기에 따른 이동속도 차이를 이용해 분리
      • Ion exchange Chromatography  : Positive charged된 beads를 넣어 solvent의 negative charged 물질은 느려지게(retard) 하여 분리
      • Gell filteration Chromatography : 다공성(porous) beads를 넣어 작은 물질을 retard 시켜 분리
      • Affinity Chromatography : 아비딘-비오틴 또는 항원-항체 Bonding과 같은 강한 인력 관계를 이용해 특정 물질을 느려지게 하여 분리. 
    • SDS page : Sodium dodesyl sulfate 를 이용해 protein에 Negative charge를 건 뒤 강한 전기장을 건 gel에 통과시켜 ion/mass 비율에 따라 달라지는 속도차이를 이용해 물질을 분리

    Detecting proteins

    • Western Blot : SDS page 이후 gell의 protein에 형광 물질이 붙어있는 antibody를 붙여 특정 단백질을 detect.
      • 단백질을 추출할 수는 없고, 양이 얼마나 많냐는 것만 판단
      • 세포를 이루는 삼대장 DNA RNA protein ...  
        • Southern blot -> detect DNA 
        • Nothern blot -> detext RNA
        • Western blot -> detect protein 

    Indentifying proteins : detect를 너머 indentify... 

    • Mass Spectrometry 
      • to identify unknown proteins and amino acid sequence
      • Mass to Charge ratio에 따른 도달시간 detect 
      • 두번하면 tandem MS 라고 더 정밀함. 

    Determining Protein Structure 

    • X-ray Crystallography : 시료에 X선을 조사해서 회절무늬로 단백질의 구조를 분석
      • 시료를 만들만큼 양이 충분치 않거나, 시료를 만들더라도 쉽게 깨지는 단백질 연구에 한계
    • NMR : 양성자와 중성자의 Spin을 더해 뭘 한다고 하는데 교수님께서 대충 설명하심. 궁금하면 위키참고 (https://namu.wiki/w/NMR#s-2.1 물론 나무위키) 
    • Cryo-EM : Cryo라는 이름이 붙으면 보통 뭔가를 냉동하는 거임. EM은 전자현미경의 줄임말. 다시말해 단백질을 급속도로 냉각시키고 전자현미경으로 관찰한다는 뜻인데, 급속냉각할 경우 시료가 잘 깨지지 않는다는 장점이 있음. 최근들어 가장 많이 사용되는 방식. 

    Determining Protein function(단백질의 아미노산 서열 분석) : BLAST, ClustalW

    단백질의 구조로부터 단백질 아미노산 Sequence를 분석할 수 있는데, Sequence 분석은 BLAST 또는 ClustalW의 기법으로 이루어진다. 단백질의 아미노산 서열은 G : Glycine, A : Alanine 이런 아미노산들이 GAKEIRLD... 이렇게 연결되어 있는 식이다. 

    Analyzing and Manipulating DNA : Recombinant DNA, Restriction Enzyme(nuclease), Gel-electrophoresis, Gene cloning, PCR

    Recombinant DNA (재조합 DNA) 

    DNA를 아주 세밀하게 조작하는 기술을 말한다. 우리가 DNA 염기 서열 중 특정 염기 서열을 인식하고 그를 다른 서열로 교체할 수 있는데, 그것은 바로 제한효소(Restriction Enzyme  or Nuclease)와 Ligase를 이용해서 진행한다. 

    Restriction Enzyme(nuclease) and Ligase

    특정 서열을 자르는 건 제한효소로 하고, 자른 뒤 딱풀로 붙이지 않고 Ligase라는 효소를 이용해 부착한다. 자르는 방식에 따라 분류하는데 Haelll, EcoRl, Hindlll 가 있다. 맨 앞은 그냥 댕강 깔끔하게 자르는 경우이고, 뒤에 두개를 각 서열의 한쪽  strand를 노출시키는데 이러면 다른 염기가 잘 붙을 수 있으므로 Sticky 하다고 한다. 

    Gel-electrophoresis

    DNA의 Backbone은 Phosphate로 (-) charge를 띄고 있으므로, 전기장을 걸어주면, 단백질로 SDS Page 하듯이 DNA를 크기별로 분류할 수 있다. 

    Gene cloning

    특정 DNA 서열을 플라스미드(Plasmid)에 넣고 세균을 막 분열시켜서 특정 서열을 어마어마 하게 많이 복제해내는 기술이다. 이때 큰 염기서열은 F plasmid라는 곳에 넣어야 한다. 

    PCR (Polymerase Chain Reaction)

    PCR 에 자주 등장하는 용어들 

    • De-naturation : double strand 를 두 가닥으로 떼주는 과정 (고열)
    • Re-naturation : 반대로 두개를 붙여주는 과정 (냉각) 
    • Hybridization : 붙이는건 붙이는 건데, 특정 서열을 붙이는 것을 의미함. 이는 보통 DNA에 어떤 서열이 존재하는지를 확인하는 In situ hybridization에서 자주 나타남. 

    PCR의 과정 (3 step)

    1. De-Naturation : High temp 
    2. Annealing : Attaching Primers (cooling)
    3. Extension : DNA synthesis

    한 사이클 당 2배로 불어남, 따라서 10 사이클에 \(2^10 = 1024 , \) , 20승은 약 1백만, 40승은 약 1... 이에 따라 아주 작은 서열을 매우 크게 증폭 시킬 수 있어서  diagnostic 에 많이 쓰임 (gel electrophoresis)

    Real time PCR

    computerized optics를 이용해 한번에 여러개를 동시에 볼 수 있음. 특정 threshold 농도를 넘을때까지 복제해야하는 cycle의 수를 유전자 별로 세서 그래프에 나타냄. cycle의 수가 적을 수록 초기 농도가 높음을 의미하고, cycle의 수가 1차이난다는 것은 농도가 2배 차이 남을 의마한다. 예를들어 농도차이가 10배 나는 유전자라면, 2의 3.5승이 10정도 이므로 3.5칸 차이날 것이다. 

    Sequencing : Sanger sequencing, Next generation sequencing, microarray, ChIP & ChIP-Seq, Ribosome profiling 

    PCR에 기반한 다양한  Sequencing기술들이 있다. 전통적인 Sanger sequencing과 NGS, microarray 등이 있다. 

    Sanger sequencing

    dNTP와 ddNTP : 3번 탄소에 OH가 결합되어 있냐 마냐로 구분되는데, OH기가 있는 dNTP는 다른 dNTP의 5번 탄소 인산기와 결합하여 DNA 연결이 지속 될 수 있음. 그에 반해 ddNTP는 DNA 복제(Extension)가 그 자리에서 중단 됨.

    과정 

    1. Single Stranded DNA fragment와 수많은 dNTP, DNA Polymerase를 준비한다.
    2. 소량의 형광 표지된 ddNTP를 같이 넣는다. 
    3. 이후 Gel electrophoresis를 진행하면 크기별로 DNA fragment들이 나열된다. 
    4. 순서대로 형광빛을 분석하여 서열을 읽어낸다. (멀리간것이 작은것)

    Next generation sequencing

    https://www.youtube.com/watch?v=CZeN-IgjYCo 

    Sanger Sequencing에 비해 훨씬 빠른 Sequencing 기법. fragment들을 surface에 고정해두고 PCR을 돌려주면 위 그림처럼 다양한 길이의 DNA 가 형성이 되고, 여기에 형광표지된 dNTP들을 붙여 읽어내면 sequence를 알 수 있다.

    microarray

    https://youtu.be/NgRfc6atXQ8

    Sample 1과 2 세포를 비교하는 방법. 각 array의 칸 마다 특정 gene의 서열 probe가 붙어있다. sample 1과 2의 mRNA들을 형광표지 한 후 microarray에 뿌리고 씻어내면, 각 칸의 gene 에 complementary (상보적) 서열이 있는 mRNA들만 남아있다. 그 말은 해당 유전자가 그 mRNA에서 express 된다는 뜻이다. 만약 두 형광이 green과 red로 되어있다면 yellow는 두 샘플 모두에게서 발현되는 유전자이다. 

    ChIP & ChIP-Seq

    https://youtu.be/rlnN0DklF40

    DNA-Protein Interaction을 알아내는 강력한 도구. 특정 전사인자가 상보적으로 결합하는 DNA Sequence가 무엇이냐를 알아내는 방법. 우선 전사인자를 DNA 에 붙여준 뒤 포름알데히드를 처리하여 DNA 와 Protein을 fixation시켜주고, 이후 DNA를 fragment단위로 쪼개준 뒤, 전사인자 단백질에 자성을 띈 antibody를 붙인 뒤 자성을 이용해 해당 전사인자-DNA Sequence complex를 purification해주고, 포름알데히드 처리를 제거해주면 Sequence만 남게 된다. 

    Ribosome profiling 

    https://youtu.be/mnuSkhRyBCg

    Ribosome footprint라고 하는 Ribosome이 결합하는 RNA Sequence를 알아내는 방법. 기본적 원리는 ChIP과 유사하다. 

    Gene expression and function  : genotype and phenotype , Types of Mutation 

    genotype 유전형 : homozygous 와 heterozygous

    유전자(gene)의 전체 집합을 genome이라 부른다. locus란 특정 유전자가 genome에서 배치된 위치를 의미하고, 대립 유전자(allele)은 어떤 유전자의 다른 형태를 의미한다. 예를 들어 코카콜라가 유전자라면  allele은 코카 제로, 코카 라이트, 코카 오리지널 요런 느낌. (https://m.blog.naver.com/PostView.naver?isHttpsRedirect=true&blogId=sw4r&logNo=221137516721 ) 

     위의 물고기 그림을 보자. 우선 homozygous 와 heterozygous가 있는데, 전자를 동형접합 후자를 이형접합 이라고 한다. 동형접합이란 우-우 접합이나 열-열 접합을 의미하고, 이형접합은 우-열 접합을 의미한다. 

    phenotype 표현형 : Wild type and Mutant

    Genotype 이 달라도 Phenotype이 같을 수 있다. 그건 유전자의 우성/열성에 의해 결정된다. 위 그림에서. wild type이 우성이다. 이에 따라 A/A 접합과 a/A 접합은 genotype은 다르지만,  둘다 Wild type으로 phenotype이 같다. a/a homozygous만 mutant phenotype을 보인다. 이는 Diploid(2배수체)인 체세포가 haploid인 생식세포로 분열할때 어떤 gene이 유전되느냐에 따라 결정된다.

    Types of Mutation 

    • point mutation
    • Inversion
    • Deletion
    • In-Del : inversion + deletion
    • lethal mutation
    • conditional mutation
    • loss of function mutation
    • gain of function mutation
    • dominant negative mutation (근묵자흑)

    기타

    Epistasis

    개념만 알고 가라고 한다.  mutant를 각기 다른 부위에 만들어서 기작들의 순서(Order)를 분석한다. 

    Synthetic lethality

    안젤리나 졸리의 유방/난소 절개로 유명하다. Gene A와 Gene B 모두 없다면(And 조건) 세포가 사멸하는(lethal) 현상이다. 

    Polymorphism

    다형성(多形性, polymorphism), 다형(多形), 다형 현상은 생물학과 동물학에서 동종 개체들 가운데에서 2개 이상의 대립 형질이 뚜렷이 구별되어 나타나는 것을 말한다. 이러한 맥락에서 다면발현성(polyphenism)이라고도 한다. (위키백과 :https://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%8B%A4%ED%98%95%EC%84%B1_(%EC%83%9D%EB%AC%BC%ED%95%99) 

    기능의 차이는 없지만, 형질이 뚜렷이 차이나는 경우를 의미한다.

    Reverse genetics 

    Maipulate gene(유전자 조작) -> mutation -> phenotype 분석으로 연구하는 것을 Reverse genetics라고 한다. 기존 연구는 표현형으로부터 mutation를 관찰해 유전자를 연구한다. 

    Transgenic and Knockout mouse

    • Transgenic mouse : gain of function transgene (이건 over population에 의한 현상일수도 있어서 잘 안함) 
    • Knockout mouse : loss of function (이걸 선호) 

    mutant cell을 배아에 넣어서 길르면, 부위마다 정상 세포도 있고 mutant 세포도 있다. 이런 쥐들을 교배하면 mutant로만 이루어진 쥐가 생길 수 있다. 이후 wild type 과의 비교를 한다.

    • Conditional Knockout mouse

    Cre 라는 유전자를 폐에서만 발현시키고 싶다. loxP loxP 를 Cre가 인식해서 잘라내는데 이 loxP를 Inversion 시키거나 translocation 해서 Cre가 작용하지 못하게 할 수 있나보다. 뭐라는지 모르겠으니 궁금한 사람은 아래 영상 참조 https://youtu.be/oLPjiwM0G7A

    Reporter genes

    특정 유전자가 언제 어디에서 express 되는 지를 알려준다. 

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